產(chǎn)品及特點(diǎn)：
傳染性脾腎壞死病病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV）會引起傳染性脾腎壞死病，是以脾、腎壞死為主要病理特征的一種病毒性疾病。病魚嘴張大，呼吸加快，食欲下降，魚體變黑，有時有抽筋樣顫動；頭部充血，口四周和眼出血；脾臟腫大、糜爛和充血，呈紫黑色；腎臟腫大、充血和潰爛；肝臟腫大，有缺血狀、土黃色或有淤血點(diǎn)等癥狀；常見有腹水，腸內(nèi)有時充滿黃色粘稠物，膽囊腫大；鰓貧血，發(fā)白，伴有寄生蟲或細(xì)菌感染出現(xiàn)出血、腐爛等現(xiàn)象。傳染性脾腎壞死病主要流行于我國南方淡水養(yǎng)殖的鱖中，具有很高的死亡率，對鱖養(yǎng)殖業(yè)造成很大的威脅，嚴(yán)重危害我國鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，因此傳染性脾腎壞死病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的傳染性脾腎壞死病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒。
1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)傳染性胰臟壞死病病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：
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編號
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×qRT-PCR 緩沖液
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500 μL（棕色管）
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試劑二
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10×qRT-PCR 酶混合液
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100 μL（紅蓋）
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試劑三
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ROX 染料 I，50×
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20 μL（棕色管）
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試劑四
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ROX 染料 II，50×
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20 μL（棕色管）
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試劑五
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1mL（黃蓋）
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試劑六
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傳染性胰臟壞死病病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液
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100 μL（白蓋）
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試劑七
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傳染性胰臟壞死病病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 （1×10E8 /μL）
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50 μL（黃蓋）
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試劑八
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沙核酸釋放劑（試用裝）
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20 次（1mL，綠蓋）
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試劑九
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使用手冊
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1 份
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運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋陽性對照：
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：
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成分
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N+2個制備
所得樣品
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qRT-PCR
陰性對照
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qRT-PCR陽性對照(2-7管)
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2×qRT-PCR緩沖液
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10μL
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10μL
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各10μL
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傳染性胰臟壞死病病毒染料法qRT-PCR引物混合物
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2μL
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2μL
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各2μL
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50×ROX (見注)
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0.4μL
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0.4μL
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各0.4μL
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樣品制備所得RNA
模板(來于第8步)
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5.6μL
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--
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--
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稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)
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--
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--
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各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管
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超純水
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--
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5.6μL
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10×qRT-PCR酶混合液
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2μL
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2μL
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2μL
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注：需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。
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過程
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溫度
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時間
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RT（逆轉(zhuǎn)錄）
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50℃
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15-30 min
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預(yù)變性
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95℃
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5 min
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Qrt-PCR反應(yīng)40個循環(huán)
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95℃
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15 sec
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58℃
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1 min,（采集FAM通道的熒光信號）
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按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析
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四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
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