歡迎來到上海通蔚！

021-54845833/15800441009

品質(zhì)保證 · 通蔚試劑

當(dāng)前位置: 首頁 > 科研產(chǎn)品 > PCR試劑盒 > 染料法PCR試劑盒 > 蘆根染料法PCR鑒定試劑盒

  • 蘆根染料法PCR鑒定試劑盒

    規(guī)格：
    數(shù)量：

    購買數(shù)量

    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW39949
    • 應(yīng)用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 商品庫存：100
  • 商品詳情
  • 參考文獻(xiàn)
  • 說明書下載
  • 商品評論0
  • 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品及特點(diǎn)： 
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)蘆根保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。 。
規(guī)格及成分：

編號

成分

規(guī)格

試劑一

2×qPCR MagicMix

500 μL（棕色管）

試劑二

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1 mL（黃蓋）

試劑三

蘆根染料法PCR 引物混合液

100 μL（白蓋）

試劑四

蘆根染料法PCR 陽性對照(1×10E8 /μL)

50 μL（紅蓋）

試劑五

DNA 病毒裂解液（試用裝）

15 次（9 mL）

 

使用手冊

1 份

運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝)或第 5 號(濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次一管式病毒DNAout。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行)：

10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)：

成分

樣品管 N+2個

PCR陰性對照管

PCR陽性對照管(2-7管)

2×qPCR MagicMix(棕色管)

10μL

10μL

各10μL

蘆根PCR引物混合液(白蓋）

2μL

2μL

各2μL

自備10×ROX(見注)

2μL

2μL

各2μL

N+2待測樣品DNA模板

6μL

不加

不加

第7步所得PCR陽性對照稀釋液(2-7號)

不加

不加

各6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。

過程

溫度

時間

預(yù)變性

92℃

5分鐘

PCR反應(yīng)30個循環(huán)

94℃

60秒

50℃

60秒

72℃

60秒

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，最大吸收光譜在471nm，結(jié)合DNA時的最大吸收光譜在500nm，最大發(fā)射光譜在530nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！